大家好,小东方来为大家解答以上的问题。冰冻切片免疫荧光实验步骤，免疫荧光实验步骤这个很多人还不知道,现在让我们一起来看看吧！

1、包埋好的标本用切片机切石蜡切片(5微米)，并将蜡片贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片上。

2、经60℃烘片2-8小时（都试过，没啥差别，但非实质性器官应适当延长时间）。

3、二甲苯Ⅰ脱蜡30分钟（若要保证脱蜡完全可将其加热至40-60℃），二甲苯Ⅱ脱蜡10分钟。

4、梯度酒精复水：100%酒精3分钟，100%酒精3分钟，95%酒精3分钟，85%酒精3分钟,75%酒精3分钟， 50%酒精3分钟，蒸馏水3分钟，蒸馏水3分钟，PBS 5分钟。

5、进行抗原修复：将切片置于0.1mol/L且ph=6.0的枸橼酸液修复液中，用微波炉100火力三分钟至微微沸腾，再用50火力维持7分钟，停止加热后自然冷却20-30分钟。

6、用PBS 3分钟，用滤纸擦去标本外的PBS，滴加封闭血清（无色的5�S或免疫组化试剂盒北京中衫中的封闭液）在湿盒中37℃封闭30分钟（室温30分钟也可）。

7、用滤纸擦去封闭液，勿洗。

8、滴加适宜浓度的一抗置湿盒中4℃孵育过夜（37℃1小时多也差不多），再用PBS 3分钟×5次洗去一抗，用滤纸擦去标本外的PBS。

9、滴加荧光二抗室温置湿盒中避光孵育1小时，用PBS 3分钟×3次洗去二抗，用滤纸擦去标本外的PBS。

10、滴加DAPI 避光孵育2分钟，可对标本进行显核，蓝色荧光，效果极佳。

11、用PBS 1分钟×3次洗去DAPI，用滤纸擦去标本外的PBS。

12、最后用含甘油封片，并在荧光显微镜下立即观察。

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